中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)是一种胞内水解酶。测定其活性对于某些病的诊断、鉴别诊断和疗效观察有重要价值。目前国内推荐的改良Gomori钙钴法(简称改良法)，其孵育时间长达4 h，试剂配制繁琐，我们将生物化学中有关磷酸基受体缓冲液的原理应用于NAP染色，即在改良法的基础上，以2-氨基-2-甲基-1-丙醇(AMP)为缓冲体系，建立一种简便快速染色法(简称快速法)，孵育时间只需15 min，报道如下。

　　一、材料与方法

　　1.主要试剂：(1)固定液：10%甲醛甲醇溶液。(2)基质液：200 g/L β-甘油磷酸钠溶液。(3)缓冲液(pH 9.6)：1.0 mol/L AMP溶液，内含钙离子0.03 mol/L和镁离子0.005 mol/L(用2 mol/L盐酸调 pH)。(4)基质缓冲液(pH 9.6)：取上述基质液0.5 ml加入9.5 ml缓冲液中即可(临用时配制)。

　　2.方法：(1)新鲜血片或骨髓片，干燥后用固定液固定10 s，流水冲洗晾干。(2)取已37℃预温的基质缓冲液约1 ml均匀涂布血膜，37℃孵育15 min，水冲洗晾干。(3)20 g/L硝酸钴溶液作用5 min，流水冲洗晾干。(4)10 g/L硫化铵溶液作用1 min，流水冲洗晾干。(5)5 g/L沙黄溶液复染5 s，冲洗晾干镜检。(6)结果判断标准与报告方式同有关文献[1]。

　　二、结果

　　1.方法学选择：用NAP活性较高的血涂片染色，计数两次求均值()作为统计学参数。(1)AMP浓度选择用1.0 g/L β-甘油磷酸钠配制不同浓度的AMP基质缓冲液，对同一份标本进行快速法染色，结果显示当AMP浓度达到1.0 mol/L时，NAP积分和阳性率基本达到平衡。(2)β-甘油磷酸钠浓度选择用1.0 mol/L AMP缓冲液(pH 9.6)，配制不同浓度β-甘油磷酸钠基质缓冲液，进行快速法染色，结果显示当β-甘油磷酸钠浓度达到10 g/L时，NAP积分和阳性率达到平衡。(3)笔者还对最适pH和最适温度以及钙、镁离子浓度进行了选择，结果以pH 9.6、37℃最适，钙、镁离子分别以0.03和0.005 mol/L为最佳。(4)最佳孵育时间的选择：上述最佳条件对同一份标本孵育不同时间，绘制孵育时间积分及阳性率曲线，结果孵育15 min已达到平衡，且在2 h内基本稳定不变。

　　2.方法学评价：(1)120份标本同时进行快速法和改良法，经配对t检验，其NAP积分分别为97.7±8.4和96.5±10.6，差异无显著意义(P>0.05)。(2)重复性试验：经实验快速法批内和批间CV分别为0.029和0.052。(3)阴性对照试验：将阳性标本经固定后置沸水煮10 min，染色结果阴性。(4)参考范围：80例健康人参考范围NAP积分为58.1(2～127)，平均阳性率34.2%(2%～74%)，与改良法相似。

　　三、讨论

　　碱性磷酸酶(ALP)催化β-甘油磷酸钠生成甘油和无机磷酸根，AMP作为磷酸基受体，能不断结合磷酸根，加快正向反应速度。磷酸基受体在酶上有结合位点，且遵循Michatelis-Menten动力学，在ALP的催化机理中，转磷酸反应比磷酸水解反应拥有更高的Vmax，因此ALP更易将磷酸根转移到受体上，当有合适的磷酸基受体存在时，ALP酶促反应有较高的Vmax/Km值，反应速度会显著增加。

　　磷酸基受体与水竟争结合共价吸附于酶活性部位丝氨酸上的磷酸根，必须依赖高浓度磷酸基受体才能显著增加酶促反应速度。但高浓度磷酸基受体也会引入抑制酶活性的杂质。此外，磷酸基受体亦用作缓冲体系，调节反应的pH，而且更重要的是pH对磷酸钙溶解度的影响，即pH太低会使磷酸钙溶解度增加，导致假定位或假阴性。反之pH太高会导致阳性颗粒散于细胞外，或造成细胞膜不同程度的破坏。因此，维持一定pH(9.6±0.2)十分重要。

　　该法基质缓冲液配制简便，AMP作为磷酸基受体加快了反应速度，因而，孵育时间仅需15 min;采用5 g/L沙黄溶液复染，便于对比观察;整个实验可在30 min内完成，具有简便、快速的特点。