第四讲   流式细胞术

一、流式细胞术简介
    流式细胞术（Flow Cytometry FCM）是一种对单细胞或其他生物粒子膜表面以及内部的化学成分进行定量分析和分选的检测手段，它可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数，同传统的荧光镜检查相比，具有速度快，精度高准确性好等特点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。自20世纪70年代以来，随着流式细胞技术水平的不断提高，其应用范围也日益广泛。目前，流式细胞已普遍应用于免疫学、血液学、细胞生物学、细胞遗传学、生物化学及肿瘤学等临床医学和基础医学领域。

    流式细胞仪集电子技术，计算机技术、流体理论于一体，是一种非常先进的检测仪器。流式细胞仪的发展始于1953年，Parker和Horst设计一种全血细胞计数器装置，该仪器成为流式细胞仪的雏形。其原理是先将全血细胞进行染色，白细胞染为蓝色，红细胞仍为红色，当细胞悬液通过检测细玻璃管时用一束光进行照射，不同细胞所发出的蓝光或红光经过滤光片后分别由两个光电转换器转换为电信号，再由计数电路分别计数。

二、流式细胞仪的组成及工作原理
（一）流式细胞仪由五部分组成：1、流动室及液流驱动系统。2、激光光源及光束成形系统。3、光学系统。4、信号检测与存贮、显示、分析系统。5、细胞分选系统。

（二）FCM基本原理
    将待测细胞染色后制成单细胞悬液。用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的磷酸缓中液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样，鞘液就能够绕着样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。流式细胞仪通常以激光作为激发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下产生散射光和激发荧光。

这两种信号同时被前向光电二极管和90度方向的光电倍增管（PMT）接收，光散射信号在前向角度10.5-2.0度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积大小；荧光信号的接收方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模／数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。

    计算机采集所测量得到的各种信号进行计算处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，也可以打印出来，还可以数据文件的形式存贮在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。细胞的分选是通过分离含有单细胞的液滴而实现的。在流动室的喷口上配有一个超高频的压电晶体，充电后振动，使喷出的液流断裂为均匀的液滴，待测细胞就分散在这些液滴之中。将这些液滴以正负不同的电荷，当液滴流经带有几千伏的偏转板时，在高压电场的作用下偏转，落入各自的收集容器中，不予充电的液滴落入中间的废液容器，从而实现细胞的分离。
三、流式细胞仪的临床应用
（一）FCM在免疫学中的应用
1、外周血T淋巴细胞亚群的测定
正常机体中各淋巴细胞亚群相互作用，维持着机体的正常免疫功能。当不同淋巴细胞亚群的数量和功能发生异常时，可导致免疫紊乱并发生一系列的病理变化。

      越来越多的研究表明，T淋巴细胞亚群在某些临床疾病如自身免疫性疾病、免疾缺陷性疾病、变态反应性疾病、病毒感染、恶性肿瘤等均有异常改变。因此，T淋巴细胞亚群的检测对控制这些疾病的发生发展，了解疾病的机制、指导临床治疗都有极其重要的意义。

2、FCM在艾滋病监测中的应用
艾滋病，即获得性免疫缺陷综合征（AIDS），是由于人类免疫缺陷病毒（HIV）侵犯T辅助淋巴细胞（TH）所致。发病后由于病毒在CD4+细胞内繁殖，导致溶解性破坏，致使CD4+细胞数量显著下降，继而累及各免疫功能器官，造成全身免疫功能下降，最终因各种继发性感染和肿瘤而发病死亡。由此可见，CD4+T细胞绝对计数及其在淋巴细胞中的比例对AIDS的检测起着至关重要的作用。

3、细胞内染色和细胞因子的测定
人体内的免疫细胞和某些非免疫细胞具有合成和分泌小分子多肽功能，这些小分子参与调节多种生理功能和细胞功能，统称为细胞因子（cytokine)。对细胞因子的研究，有助于在分子水平阐明免疫调节机制，有助于疾病的预防、诊断和治疗，特别是利用相应的细胞因子，在治疗肿瘤、感染、造血功能障碍、自身免疫疾病等方面已取得令人满意的效果，前景乐观。因此，细胞因子的检测和研究正成为一个热门题目。

（二）流式细胞术在血液病学中的应用
1、白血病免疫分型
白血病免疫分型是利用单克隆性抗体检测白血病细胞表面和胞浆内抗原，分析其表现型，以了解被测白血病细胞所属系列及其分化系列，它是研究白血病分化抗原和诊断白血病的重要手段。

     从多能造血干细胞（PHSC）分化成熟为功能细胞的过程中，细胞表面和细胞浆内抗原随着分化成熟过程不断发生改变，这些抗原称为造血细胞分化抗原。如，髓系细胞的CD33 、CD13 、CD14、CD15等抗原，巨核系的CD41、 CD42、 CD61等抗原，T淋巴细胞的CD2、CD3、CD4、CD5 、CD7、 CD8等抗原，B淋巴细胞的CD19、CD20、CD22等抗原。

2、淋巴瘤的免疫分型
通常淋巴瘤细胞表达B细胞（smIg, CD19, CD20, CD5）,T细胞（CD2,CD3,CD5,CD7,CD8,）或T/B细胞表型．这些复杂的表型与细胞形态亚型关系不大，也没有发现一致性的预后意义。它主要用于鉴别诊断，如滤泡性淋巴瘤，主要表达B细胞标志，但不表达CD5，可以区分滤泡性淋巴瘤白血病和慢性淋巴细胞型白血病。

3、白血病微小残留病变和化疗效果的监测
      微小残留病变（MRD）是白血病复发的根源。对MRD的早期监测，可避免复发，延长缓解期。常规检测方法（如形态学检查、组化和血清学检查）难以发现MRD，只能采用免疫表型、细胞遗传学（FISH荧光原位杂交）和PCR等方法进行检测。由于单纯的分子生物学方法检测MRD具有一定的局限性，而FCM可以同时定量测定多个参数，结合分选功能，可以分出感兴趣的细胞，进而研究其它分子生物学特性。所以FCM与分子生物学技术相结合可进一步提高检测水平。

4、骨髓移植和干细胞移植的监测
(1)移植前监测骨髓和外周血造血干细胞为保证移植重建的成功，每千克体重至少需要1.2×106个CD34+细胞，早期造血重建依赖祖细胞，持久的植活依赖干细胞，因此移植中必须有足够数量不同分化阶段的造血干／祖细胞。CD34+细胞是造血干／祖细胞的特异性标志，联合应用其他分化抗原如CD38, CD33, CDw90, HLA - DR等，用免疫双标记或多重标记法通过FCM可以测定出CD34+细胞总数及各分化阶段干／祖细胞数。

(2)移植后监测免疫功能移植后细胞免疫表型的变化有助于推测骨髓重建是否正常进行，骨髓恢复正常则表现为：自然杀伤细胞（NK）增多，并出现少见细胞表型细胞，如NK细胞表达少量CD8、CD5阳性的B细胞，CD4, CD8阴性的T细胞。

5、流式细胞术在免疫血液病中的应用
（1）阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)的临床论断  PNH是一种以补体介导的血管内溶血为特征的造血干细胞克隆性疾病。目前研究证明，PNH患者的血细胞膜上缺乏多种糖化肌醇磷脂结合蛋白（GPI锚蛋白），如C3转换酶衰变加速因子（CD55）、反应性溶血膜的抑制物（CD59）等，致使血细胞对补体异常敏感，出现血管内溶血为特征的一系列症状。

国内大多数医院实验室诊断PNH仍限于溶血实验，此法并非特异性诊断实验，而通过流式细胞仪及免疫荧光技术检测外周血红细胞膜、白细胞膜及网织红细胞膜上CD55和CD59的表达，将是诊断PNH的重要手段。

（2）免疫性血小板疾病和中性粒细胞减少症的临床诊断  原发性血小板减少性紫癜和中粒细胞减少症患者血液中存在着抗血小板抗体和抗白细胞抗体，流式细胞仪可以用于这些抗体的分析。
6、血小板膜表面受体测定在血栓性疾病方面的应用
目前认为，与血小板功能有关的血小板膜受体有Ⅱb、Ⅲa、IIb/Ⅲa复合物、Ⅱb、vWF、 GMP140 、Fg等。其检测方法不尽相同，有SDS-PAGE法、交叉免疫电泳法等等，这些方法难于检出含量较低的膜受体。免疫印记法的灵敏度较高，但标本用量大，操作复杂，膜纯化过程中受体变化大、易丢失，因此临床实验室较少应用。

放免法则易受其他细胞的干扰或因一个抗原分子结合多个抗体而测定结果不准确。以FCM测定血小板膜受体，是分析血小板功能方法学上的一大进步，该方法测定准确、快速、特异，操作方便，重复性好，标本用量少，非常适合于临床常规检测。

7、在贫血中的应用
 网织红细胞分析是临床上监测贫血的一个重要指标。人工镜检仍普遍用于网织红细胞计数。但许多研究证明，镜检法计数精确性差，受人为因素干扰大，而且用肉眼无法准确判断网织红细胞的成熟程度（RNA含量），随着流式细胞仪及一系列自动化网织细胞分析的出现，不但能快速、准确地计数网织红细胞（RET％）(1分钟内测定10000个细胞以上)，而且可提供新的评价红细胞生成活性的参数-网织红细胞成熟指数（RMI）。

（三）流式细胞仪在细胞增殖和肿瘤病理研究中的应用
1、细胞周期和DNA倍体分析
   FCM进行DNA分析的原理在生物细胞中，DNA含量是比较恒定的参量，DNA含量随着细胞增殖周期各时相发生变化。Go /G1期细胞的DNA含量为二倍体DNA含量，是较恒定的2C值；S期细胞的DNA含量较二倍体高但低于四倍体，即从2C值～4C值；G2/M期细胞的DNA含量为四倍体含量，是较恒定的4C值。

2、碘化丙啶(PI)的荧光标记法
     对于标记DNA的荧光探针目前最常用的是PI，PI是属于插入性荧光染料，可选择性地定量嵌入核酸双螺旋的碱基之间，其荧光发射为橙红色，如果使用氩离子激光488nm激发，PI发射光谱波长在610-620nm范围，PI的优点是荧光发射强度大，其CV值较小，PI的最佳浓度为50g/ml, PI不能通过活细胞膜进入细胞内与核酸结合，因此可以用于鉴别死活细胞。

在染色活细胞时，要采用膜打孔方法，把染料引入细胞内，或将细胞固定。另外，PI可与双链RNA结合，故在染色细胞DNA时首先要用RNA酶处理细胞，以排除RNA对定量DNA含量精度的干扰。

（四）FCM在细胞凋亡研究中的应用
1、DNA含量分析由于凋亡细胞DNA被降解后，小分子DNA可通过细胞膜逃逸于细胞外，另外凋亡小体也可带走部分DNA，造成了凋亡细胞的DNA含量非倍体性下降，由此可导致对DNA染料的着色能力下了，表现在G1期峰前出现亚二倍体峰，称为亚G1期峰（凋亡峰）。

2、细胞膜结构的改变在凋亡细胞的形态学改变中，胞浆膜的改变是最早出现的。凋亡的早期阶段可检测到快速、持续的细胞内钙离子升高，大量的钙离子激活谷氨酰胺转移酶，谷氨酰胺转移酶的活化使胞浆膜磷脂的对称性丧失，导致膜内侧磷脂酰丝胺酸（PS）从细胞膜内层暴露于外层，从而可被PS特异的Annexin-V探针所标记。Annexin-V为35-36KD的钙离子依赖性磷脂复合蛋白，对PS有极强的附着力，并可被FITC、PE、Biotin等荧光物质标记。

此方法简单、可靠，由于凋亡时细胞膜的改变大大早于DNA的改变，因此Annexin-V染色是检测早期凋亡细胞的敏感方法。但是该方法无法区分凋亡晚期细胞和坏死细胞，因此必须用活细胞。

3、DNA断裂点标记DNA裂解是细胞凋亡的最后一步，由于核酸内切酶活化，使得核小体内DNA断裂为50-300kb的片断，继而裂解为200bp的DNA碎片。由于碎片的产生暴露出多个3’-OH末端，利用脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)，能够催化外源性的dUTP或Brd- UTP连接到DNA碎片的3’-OH末端。

以荧光物质标记dUTP或抗BrdUTP单抗，就可以用FCM检测到UTPB或rd-UTP的数量，从而间接检测到凋亡过程中DNA碎片上所带的3’-OH末端。此方法灵敏度高、特异性好，目前已被广泛采用。检测3'-OH末端的同时还可以与PI双染色，进一步检测到细胞DNA含量。
（五）其他应用
1、染色体流式核型分析
用流式细胞仪分析和分选人类染色体是分子生物学和遗传学研究中一个非常有效的方法，通过此法，研究者可进行核型分析和鉴定，分离纯化某号染色体并构建染色体特异性DNA文库，这在遗传病基因定位、基因克隆方面发挥着重要的作用。

传统的核型分析采用分带技术显示出不同染色体的特征信息，然后再显微照相、放大、剪接、组型，这种方法不但费时而且无法排除人为主观因素的干扰。目前仪器自动分型的方法有两种：一是采用图像技术的静态方法；二是采用流式细胞术。后者不但能分析染色体，还能纯化得到克隆实验所要求的染色体，这是其他任何技术都无法完成的。

2、流式染色体分析的临床意义：目前，染色体分析已广泛应用于产前诊断、遗传性疾病、放射性损伤、肿瘤细胞染色体分析等多方面的研究。但传统的染色体显带技术分辨率低，人为因素干扰大，而流式核型分析分辩率高，可以分辨显微镜下观察不到的变异，且每分钟分析的染色体数目远远大于人工显微镜计数。

3、细胞内钙离子（Ca2+）的测定
Ca2+ 作为细胞信使，参与许多的生命过程，测量活细胞内Ca2+ ，在细胞生物学中有广泛的意义。作为Ca2+ 的荧光探针，Fluo-3有着自身的特性，信噪比大，激发波长（506nm）适于流式细胞仪的氩离子激光器在488nm激发，所以越来越多地用于Ca2+ 的检测。